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承载丸治疗股骨头坏死药效学动物实验研究

  “承载丸”系列中药制剂,主要成分有:当归、黄芪、枸杞子等22味中药。功能为益髓填精,补气活血,强筋壮骨,临床用于治疗股骨头坏死,取得了满意疗效。对其进行了药效学研究,也取得了相关结果。

  1 材料制作方法
 
  1.1 动物模型制作
 
  1.1.1 股骨头坏死模型制作
  取出生后10日内大鼠乳鼠,自肘关节以上剪除前肢,自尾根部剪除尾部,烧灼止血后放回笼中,继续由母鼠喂养。一个月后,平均体重增至150g以上,开始灌服醋酸泼尼松,20mg/kg体重,隔日一次共三个月。
 
  1.1.2 骨质疏松模型制作:取体重200g±20g的雌性大鼠,手术摘除双侧卵巢,以模拟绝经后雌激素水平极度低下的机体状况。
 
  1.2 观察药物
  “承载丸”由黄克勤专家提供,剂型为大蜜丸(吉林市制药厂加工)。批文号:吉市卫药自制92002。
  1 中国中医研究院骨伤科研究所
  2 北京皇城股骨头坏死专科医院
 
  1.3组别及给药剂量和方式
  “承载丸”治疗股骨头坏死药效学观察,设正常对照组,阴性对照组,“承载丸组”。治疗骨质疏松症的药效学观察加设阿法—D3组,具体方法如下:
  1.3.1    正常对照组:骨质疏松正常对照为成年雌性大鼠,股骨头坏死正常对
  照为制作模型的同期乳鼠不作任何处理而长至成鼠。
  1.3.2    雌性对照组:两部分观察的阴性对照组分别为摘除双侧卵巢后不给任
  何药物及乳鼠剪肢一个月后,只灌服醋酸泼尼松不给其它任何药物。
  1.3.3    “承载丸组”:在灌服醋酸泼尼松的同时,开始灌服“承载丸”。按大
  鼠体表面积计算,使用成人日用量(2丸)的4倍,每日一次,共灌服三个月。骨质疏松药效学观察在摘除双侧卵巢后第三天开始灌服同上剂量的“承载丸”共三个月。
  1.3.4    维生素D对照组:使用阿法—D3(以色列梯瓦制药工业有限公司出
  品),剂量为0.0042,相当于成人维持量,每日灌服一次,共三个月。
 
  1.4 观察指标及检测方法
  1.4.1 全身骨密度:在笨巴比妥钠麻醉下使用骨密度仪(Lunar DPX)测定全身骨密度。
  1.4.2 股骨骨密度:在戊巴比妥钠麻醉下,腹主动脉放血处死动物,取一侧股骨仔细剔除软组织,在骨密度仪上测定骨密度。
  1.4.3 股骨强度、刚性测定:测定骨密度后的股骨在电子万能试验机(WD-1型,长春市非金属试验机厂出品)上进行骨强度及刚性测定。
  1.4.4 股骨湿重、干重、灰重:将测定骨强度、刚性后的股骨置电子天平上称重后,置60℃4小时烘干,称重。再置入马氏炉800℃6小时灰化,称重。
  1.4.5 股骨头毛细血管分布观察:将股骨头坏死模型动物的戊巴比妥钠麻醉下,向一侧股动物注入墨汁约5ml,取下股骨头置中性甲醛液中固定后,经酒精极度脱水处理,用甲基丙烯酸甲酯包埋,聚合,使用低速骨锯制成0.3mm—0.5mm骨片。在光镜下观察毛细血管形态及分布,用测微尺测定单位面积内毛细血管所占比例。
  1.4.6    股骨头骨组织内脂肪沉积观察:将上述动物另侧股骨头取下依次按
  70%—90% 酒精中固定,行冷冻切片,Lillie氏油红O中性脂肪染色,光镜下观察脂肪分布,并计算有脂肪着色的软骨细胞、骨细胞的比例。
  1.4.7股骨头扫描电镜观察:将股骨头坏死模型各组动物取出两只,常规制造扫描电镜标本,在扫描电镜下观察股骨头表面形态及细微结构变化。
  1.4.8 血清雌激素水平测定:取去势动物各组血清,用放免法测定雌二醇含量(血清雌二醇放免分析测定,北京北方免疫试剂研究所出品)。
  1.4.9 血清25(OH)D3含量测定:取去势大鼠各组血清用竞争蛋白结合法测定25(OH)D3含量。
 
  2 动物实验结果
 
  2.1 骨密度
  表1    “承载丸”对骨密度的影响
  骨密度表
  ▲▲与正常对照组比较P<0.01
  △与模型对照组比较P<0.05
  △△与模型对照组比较P<0.01
  由表1看出去势大鼠的骨密度明显低于正常组(P<0.01),“承载丸”能够比较明显地增加去势大鼠的骨密度,使其恢复到正常对照组的水平,而阿法—D3组在本实验的给药条件下未显示作用。
 
  2.2 骨重量
  表2  “承载丸”对大鼠股骨重量的影响
  承载丸
  ▲与正常对照组比较P<0.05
  ▲▲与正常对照组比较P<0.01
  △与模型对照组比较P<0.05
  △△与模型对照组比较P<0.01
  由表2显示:去势大鼠股骨重量(湿重、干重、灰重)明显低于正常组(P<0.05-0.01)。
  “承载丸”能够较明显增加去势大鼠的股骨重量( P<0.05-0.01)。

  2.3 股骨强度、刚性
  表3  “承载丸”对大鼠股骨强度、刚性的影响
  医学研究表
  ▲▲与正常对照组比较P<0.05
  △ ▲与模型对照组比较P<0.05
  表3显示:去势大鼠的骨强度及刚性均低于正常组(P<0.05),“承载丸”可增加去势大鼠的骨强度(P<0.05=,同时也有增加其骨刚性的趋势。

  2.4 股骨骨组织内脂肪沉积测定
  光镜下可见股骨头坏死模型大鼠股骨头髓腔脂肪组织增多,骨小梁稀疏、变细,软骨细胞及骨细胞内着脂肪染色的比例明显增加(见图9,10)。正常大鼠未见或少量脂肪滴(见图7,8)。服用承载丸后的大鼠未见或少量脂肪滴(见图11,12)。
  表4  “承载丸”对股骨头骨细胞脂肪着色的影响
  股骨头坏死研究表格
  ▲▲ 与正常对照组比较P<0.01
  △△ 与模型对照组比较P<0.01
  由表4中看出:股骨头坏死模型大鼠有软骨细胞的脂肪着色率均明显高于正常组动物(P<0.01),灌服“承载丸”后,脂肪着色率明显降低。(见图12)。

  2.5 股骨头毛细血管分布
  正常组大鼠股骨头毛细血管分布成网,有大量毛细血管直通软骨下层,呈
  扇状分布,并有横枝沟通(见图1,2),股骨头坏死模型动物的股骨头内毛细血管明显稀疏,排列紊乱(见图3,4),单位面积内毛细血管所占比例明显下降。灌服“承载丸”后,股骨头内毛细血管几乎恢复正常水平,头内密布毛细血管,排列也较规律。(见图5,6)

  2.6 股骨头扫描电镜
  在50倍扫描电镜下观察到正常大鼠股骨头表面光滑(见图13),400倍放大后,可见清晰的细胞充盈,呈网状(见图16)。股骨头坏死模型大鼠股骨头在50倍扫描电镜下观察可见表面凹陷,伴有多处裂痕(见图14),400倍放大后,多数部位失去细胞充盈的网状形态,以大束索条状纤维结构替代(见图17)。使用“承载丸”的大鼠,在50倍扫描电镜下观察股骨头表面形状恢复正常(见图15),未见股骨头凹陷, 400倍放大后,未见索条样结构,可见细胞充盈的网状结构(见图18)。

  2.7 血清雌二醇
  表6  “承载丸”对去势大鼠血清雌二醇水平的影响
  股骨头研究表格
  ▲ 与正常对照组比较P<0.05
  △ 与模型对照组比较P<0.05
  模型组大鼠血清雌二醇水平明显低于正常(P<0.05),“承载丸”组雌二醇水平明显升高,阿法-D3组有升高趋势。

  2.8 血清25(OH)D3含量测定
  表7  血清25(OH)D3含量
  股骨头坏死表格
  本实验各组之间无明显差异,“承载丸”反出现25(OH)D3水平低下。

  3 研究结论
  无菌性股骨头坏死是骨科常见的疾病,它的发病原因很多,但多围绕引起股骨头血运障碍的因素。如:股骨颈骨折,髋关节过度荷重,脂代谢紊乱,乙醇中毒,长期使用皮质类固醇等。但发病机理尚不十分明确,针对股骨头机械性血运障碍的缺血及血管本身发生变性的缺血都有人做过研究。前者,在股骨头的血管数量、血液粘度、血流速度等方面都有研究报导。WangGj曾发现股骨头坏死家兔头内血流量明显减少。
  王氏用墨汁灌注法发现股骨头坏死的头内血管极不丰富,毛细血管明显充盈不良,毛细血管数量明显减少,可见红细胞聚集现象,血流速度下降;相良耕三发现不同的血管分布情况产生了不同的病变程度。当股骨头全部血管均匀分布时,头内骨组织正常;当股骨头外侧有血管分布时,有明显的骨端部的骨化迟缓及无菌性坏死的修复;若股骨头最外侧血管消失,全部血管稀少时,则骨化及修复全无,认为形成了股骨头坏死。因此,他认为血管对股骨头坏死有修复作用。股骨头坏死是由于股骨头外侧血管断绝所致。有学者研究,股骨头坏死的微小动脉也发生坏死及出血;西塔进曾发现股骨头坏死病人的许多组织都可见微小动脉的中膜破坏,多发性出血,但大面积出血和坏死只在股骨头可见到,股骨头本身的结构决定了血管壁破坏的程度和出血频度。
  有许多人从脂肪代谢异常,脂肪常性,脂肪栓塞的角度研究了与血管分布异常及骨细胞破坏的发病机理。川井和夫等认为股骨头坏死的发生与脂代谢障碍有关,营养血管内部脂肪栓塞,骨髓内脂肪细胞肥大,骨细胞内脂肪变性都可造成血运障碍。清水富男、高岗邦夫等对长期使用皮质类固醇的死亡者股骨头进行观察发现软骨下骨小梁有广泛的骨细胞陷窝脂肪沉着,电镜见到有脂肪压迫骨细胞现象。王氏也在实验中发现股骨头软骨下区髓腔内脂肪组织增多,脂肪细胞直径增大,压迫小静脉,血管内可见脂肪栓子,电镜发现成骨细胞胞浆内可见脂滴。
  本实验研究重点在于了解使用中药制剂“承载丸”后,股骨头坏死的相关指标有否改善或转阴。又由于相当部分股骨头坏死的发生与骨质疏松相关,如果该药能够对骨质的疏松有改善作用,则更有助于确定其对股骨头坏死的疗效。因此,我们同时制作了无菌性股骨头坏死及骨质疏松症的动物模型,从实验结果来看,“承载丸”能够明显地增加骨质疏松大鼠的骨密度、骨重量、骨强度及刚性,并能改善雌激素水平低下状态。
  因此,对股骨头坏死状况的改善也得到了支持,在实验中我们看到股骨头骨细胞或陷窝处的脂滴明显减少;疏松的毛细血管得以恢复。从毛细血管的走向分布,我们也可间接观察到:正常大鼠和给药大鼠股骨头毛细血管有规律地伸向软骨下层,呈扇面状分布并有横枝沟通,说明骨小梁也有相应地改变,在脂肪染色片中,我们也看到了骨小梁的稀疏和变细。
  关于血清25(OH)D3含量的测定,没有反映明显的差别,这可能由于:

  3.1 所用阿法-D3对照药属1a-羟基维生素D3,在血中的25(OH)D3水平反映不出来。

  3.2 我们做的多次实验中去势动物模型都没有反映出25(OH)D3的作用。因此,中药对骨生长的促进作用是否有维生素D3代谢的参与,还值得探讨。关于“承载丸”组25(OH)D3水平反而低下,有待于重复实验。
  综上所述,“承载丸”对骨生长有促进作用,对治疗无菌性股骨头坏死有明确的疗效。

  4 承载丸动物实验有关图例
  股骨头坏死×40
  图1 正常大鼠股骨头毛细血管致密、粗大。排列规则,软骨下层可见密集的毛细血管。
  股骨头坏死×200
  图2   正常大鼠股骨头毛细血管呈纵横分布
  股骨头坏死×40
  图3 大鼠坏死股骨头毛细血管变细、扭曲。软骨下层毛细血管缺如。
  股骨头坏死×200
  图4 模型大鼠坏死股骨头毛细血管明显稀疏、卷曲、间断。
  股骨头坏死×40
  图5  给药组大鼠股骨头毛细血管变粗、致密排列有序。
  股骨头坏死×200
  图6 给药组大鼠股骨头可见清晰的粗大毛细血管,排列有序。
  股骨头坏死×200
  图7 正常大鼠股骨头骨细胞内未见脂肪滴,髓腔内可见丰富的血窦。
  股骨头坏死×400
  图8 正常大鼠股骨头软骨细胞内只见少量脂肪滴。
  股骨头坏死×200
  图9 股骨头坏死模型大鼠股骨头骨细胞内可见大量脂肪滴。
  股骨头坏死×400
  图10 股骨头坏死模型大鼠股骨头软骨细胞内可见大量脂肪滴。
  股骨头坏死×400
  图11 服用“承载丸”大鼠股骨头骨细胞内未见脂肪滴,髓腔内可见较丰富血窦。
  股骨头坏死×400
  图12 服用“承载丸”的大鼠股骨头软骨细胞内只见少量脂肪滴。
  股骨头坏死×50
  图13 正常大鼠股骨头在50倍扫描电镜下观察,可见股骨头表面光滑、圆润。
  股骨头×50
  图14 股骨头坏死大鼠股骨头在50倍扫描电镜下观察,可见股骨头局部塌陷,并有多处裂痕。
  股骨头坏死×50
  图15 股骨头坏死大鼠服用“承载丸”三个月后,股骨头在50 倍扫描电镜下观察,未见股骨头塌陷和裂痕等异常现象。
  股骨头坏死×400
  图16正常大鼠股骨头在400倍扫描电镜下观察,可见股骨头表面平滑及细胞充盈的网状结构。
  动物实验图片×400
  图17 股骨头坏死大鼠股骨头在400倍扫描电镜下观察,股骨头表面有凹陷并失去细胞充盈的网状结构,可见大束样的结构,结构破坏。
  股骨头坏死×400
  图18 股骨头坏死大鼠服用“承载丸”三个月,股骨头在400倍扫描电镜下观察,构像与正常大鼠相似,未见纤维样结构。